1. PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室介紹和標(biāo)準(zhǔn)：

PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其..度高達(dá)納米級(jí)別。

PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等， 實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合 衛(wèi)生部的要求， 檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、 實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全， 實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。

基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室平面布局

1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

1、 試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)

2、 標(biāo)本制備區(qū)

3、 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

3、 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。

2） 各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

3） 進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) —>標(biāo)本制備區(qū)—>擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)—>擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

4） 不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室平面圖

PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為三個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進(jìn)行。

(1)試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)應(yīng)對(duì)外界保持微正壓。

(2)標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定DNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

(3-4)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測(cè)定。此外，已制備的DNA模板(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

PCR區(qū)完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。產(chǎn)物分析區(qū)如使用全自動(dòng)分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。

(5)緩沖區(qū)與沖洗區(qū)

整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。外面有用于實(shí)驗(yàn)后消毒，消毒區(qū)域有專用清洗液和專用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。

若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。

各個(gè)區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對(duì)實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。

以下為設(shè)計(jì)的疾控中心PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的整體建設(shè)：

1、主體結(jié)構(gòu)：

主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡(jiǎn)明，美觀大方，密封性好。

2、 標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：

將PCR過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增、分析三個(gè)（或）四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個(gè)區(qū)域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。

3、 消毒：

在三個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個(gè)緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū) 還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。

4、 機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：

試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞， 試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

5、 地面

地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。

6、 照明

燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。

PCR實(shí)驗(yàn)室案例展示：

生物安全標(biāo)識(shí)

產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)

PCR標(biāo)本制備區(qū)

PCR緩沖區(qū)

PCR洗手消毒區(qū)

PCR沐浴換衣區(qū)

PCR通風(fēng)與消防區(qū) （不同區(qū)域工作人員衣服不同）

PCR負(fù)壓控制區(qū)

在建設(shè)的過程中應(yīng)注意：

●規(guī)范的安裝流程和 的服務(wù)流程。

●嚴(yán)格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計(jì)的安裝流程。

●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)水水壓，zui小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風(fēng)口尺寸。

PCR 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是分子生物學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法，也是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。實(shí)驗(yàn)室分為四個(gè)區(qū)域，進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

PCR整體實(shí)驗(yàn)室三區(qū)域分別為：

1.試劑配制區(qū)n

2.樣品處理區(qū)n

3.核酸擴(kuò)增區(qū)n

PCR實(shí)驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，若實(shí)驗(yàn)工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。

一、分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室

所謂分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室，是指完成上述實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。對(duì)于這種布置形式的PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無(wú)需特殊條件要求。

二、組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室

所謂組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室, 是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置，組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。對(duì)于組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對(duì)總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品。

如果使用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。

若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。

各個(gè)區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對(duì)實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和驗(yàn)收

擬設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)療機(jī)構(gòu)按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》籌建實(shí)驗(yàn)室；籌建完成后，由法定代表人向衛(wèi)生部臨檢中心提出技術(shù)驗(yàn)收申請(qǐng)。

申請(qǐng)時(shí)需提交以下材料：

（一）《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》復(fù)印件；

（二）可行性研究報(bào)告；

1、 擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室機(jī)構(gòu)的所在地醫(yī)療衛(wèi)生資源狀況、本機(jī)構(gòu)的基本情況、對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的需求以及臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的預(yù)測(cè)分析；

2、 擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置平面圖；

3、 擬設(shè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室將開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料

PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收條件：

1 根據(jù)衛(wèi)生部臨檢中心規(guī)定，凡是根據(jù)需要開展PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)均通過衛(wèi)生臨床檢驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收并取得合格證書方可開展工作。二級(jí)以上醫(yī)院方可設(shè)立PCR實(shí)驗(yàn)室，含專科醫(yī)院。

2驗(yàn)收規(guī)定：

三級(jí)醫(yī)院由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織專 家（一般均為各省臨床檢驗(yàn)中心主任）進(jìn)行，二級(jí)醫(yī)院由各個(gè)省臨床檢驗(yàn)中心組織專 家（一般為本省醫(yī)療機(jī)構(gòu)主任級(jí)別專 家）進(jìn)行驗(yàn)收。按照《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)提出申請(qǐng)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)收。驗(yàn)收完成后，在20日內(nèi)將驗(yàn)收?qǐng)?bào)告寄送至申請(qǐng)機(jī)構(gòu)。

驗(yàn)收人員組成：一個(gè)驗(yàn)收小組一般為3人，其中一人為聯(lián)絡(luò)小組組長(zhǎng)，其他為其他省臨床檢驗(yàn)中心主任或者本省醫(yī)院內(nèi)任職專 家。

PCR實(shí)驗(yàn)室所在科室規(guī)定：根據(jù)規(guī)定，PCR檢測(cè)應(yīng)該由各醫(yī)院的檢驗(yàn)科開展，其他科室如傳染科，皮膚科等，要求開展并申請(qǐng)驗(yàn)收的，應(yīng)該事先由各省臨床檢驗(yàn)中心認(rèn)可。

PCR實(shí)驗(yàn)室人員規(guī)定：根據(jù)規(guī)定，PCR實(shí)驗(yàn)室操作人員至少2名，且有PCR上崗培訓(xùn)合格證。

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)備：PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所需要的醫(yī)療設(shè)備均需要取得相關(guān)醫(yī)療器械注冊(cè)許可證，檢測(cè)試劑均需要取得新藥證書和藥品生產(chǎn)文號(hào)，熒光定量PCR不得使用超過五年。

PCR實(shí)驗(yàn)室 實(shí)施規(guī)定：

PCR實(shí)驗(yàn)室 驗(yàn)收時(shí)，均會(huì)給定未知標(biāo)本5份（一般是HBV-DNA，可能是近一兩年的衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)控品），要求待 實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)并打印報(bào)告單作為驗(yàn)收的重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一般要求5份標(biāo)本的定量結(jié)果必須在范圍值之內(nèi)，否則不合格。

PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室技術(shù)參數(shù)：

PCR實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域管理規(guī)定：

試劑準(zhǔn)備區(qū)工作制度

一、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該區(qū)須更換工作服，穿本區(qū)專用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、實(shí)驗(yàn)員在試劑準(zhǔn)備區(qū)接收標(biāo)本、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用的試劑。

三、實(shí)驗(yàn)員每天收齊標(biāo)本，驗(yàn)收登記后，將標(biāo)本通過傳遞 窗送入標(biāo)本制備區(qū)。  四、在試劑準(zhǔn)備區(qū)配置好試劑后放入冰箱內(nèi)備用。需要時(shí) 通過傳遞窗送入標(biāo)本制備區(qū)。

五、每天的標(biāo)本及配置的試劑須登記記錄，應(yīng)書寫工整詳 細(xì)，使用本區(qū)專用的、帶有本室標(biāo)識(shí)的記錄本、紙和筆。

六、將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出 實(shí)驗(yàn)室交醫(yī)院集中處理。

七、實(shí)驗(yàn)后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái) 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機(jī)等儀器的使用情況。

標(biāo)本制備區(qū)工作制度

一、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用藍(lán)色工作服， 戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、把已準(zhǔn)備好的試劑放入冰箱試劑存放專區(qū)暫存。

三、記錄溫濕度計(jì)讀數(shù)、冰箱的溫度。

四、嚴(yán)格按照SOP文件及試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，加樣好的PCR 管須通過傳遞窗送入擴(kuò)增及產(chǎn)物區(qū)。

五、使用本區(qū)專用的移液器及吸頭，使用過的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實(shí)驗(yàn)完畢后及時(shí)處理。將本區(qū)廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專人將垃圾帶出實(shí)驗(yàn)室交醫(yī)院集中處理。

六、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標(biāo)識(shí)的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。

七、實(shí)驗(yàn)完畢關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時(shí)間和運(yùn)行狀態(tài)。

八、實(shí)驗(yàn)后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái) 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機(jī)等儀器的使用情況。

擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)工作制度

一、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入該區(qū)須更換工作服，穿上本區(qū)專用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專用拖鞋。

二、記錄溫濕度計(jì)讀數(shù)、冰箱的溫度。

三、本區(qū)主要進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增及分析，須熟悉各擴(kuò)增儀 的使用，擴(kuò)增分析完后，記錄結(jié)果。

四、得到當(dāng)天室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果后，及時(shí)記錄在室內(nèi)質(zhì)控圖上并 進(jìn)行分析。

五、試驗(yàn)完畢后關(guān)掉擴(kuò)增儀，記錄儀器使用時(shí)間和運(yùn)行狀態(tài)。

六、每周由實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人對(duì)進(jìn)行清潔維護(hù)并記錄。

七、擴(kuò)增分析完后的反應(yīng)管，須裝入本室垃圾袋中，有專人 將垃圾帶出實(shí)驗(yàn)室交醫(yī)院集中處理。

八、使用本區(qū)專用的帶有本區(qū)標(biāo)識(shí)的記錄本、紙和筆，其他區(qū)的用 品不得帶入本區(qū)。

九、實(shí)驗(yàn)后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機(jī)等儀器的使用情況。